氨基酸自動(dòng)分析儀數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作是定量分析氨基酸含量的關(guān)鍵步驟,以下為你介紹其一般流程:
一、準(zhǔn)備工作
1.試劑與材料:準(zhǔn)備不同濃度的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,如濃度分別為 0、1、2、5、10、20、50、100 μmol/L 的混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液;還需緩沖液、衍生試劑等。
2.儀器與耗材:確保氨基酸自動(dòng)分析儀處于正常工作狀態(tài),準(zhǔn)備合適的進(jìn)樣瓶、微量移液器等。
二、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線
1.開機(jī)預(yù)熱:開啟氨基酸自動(dòng)分析儀,按照儀器操作手冊(cè)進(jìn)行預(yù)熱,使儀器各部件達(dá)到穩(wěn)定工作狀態(tài),一般需預(yù)熱 30 - 60 分鐘。
2.設(shè)置分析參數(shù):根據(jù)所分析氨基酸的種類和性質(zhì),在儀器控制軟件中設(shè)置合適的分析參數(shù),如流動(dòng)相組成及流速、柱溫、檢測(cè)波長(zhǎng)等。
3.進(jìn)樣分析標(biāo)準(zhǔn)溶液
①將配制好的不同濃度的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液依次放入樣品架,按照濃度由低到高的順序進(jìn)行編號(hào)。
②在儀器軟件中設(shè)置進(jìn)樣順序和進(jìn)樣體積,一般為 20 - 50 μL。
③啟動(dòng)分析程序,儀器會(huì)自動(dòng)依次進(jìn)樣分析每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液,并記錄色譜圖和峰面積或峰高數(shù)據(jù)。
4.數(shù)據(jù)處理與曲線繪制
①儀器分析完成后,導(dǎo)出各標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積或峰高數(shù)據(jù)。
②以氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo),對(duì)應(yīng)的峰面積或峰高為縱坐標(biāo),使用專業(yè)的數(shù)據(jù)處理軟件(如 Excel、Origin 等)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
③選擇合適的曲線擬合方式,如線性回歸、多項(xiàng)式回歸等。
一般來說,如果標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好,優(yōu)先選擇線性回歸,其擬合方程為 y=ax+b,其中y為峰面積或峰高,x為氨基酸濃度,a為斜率,b為截距。
通過軟件計(jì)算得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)R2,R2越接近1,說明標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系越好。
三、標(biāo)準(zhǔn)曲線驗(yàn)證
1.線性范圍驗(yàn)證:檢查標(biāo)準(zhǔn)曲線是否在預(yù)期的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。
如果某些點(diǎn)的偏差較大,需要重新配制標(biāo)準(zhǔn)溶液或檢查儀器狀態(tài)。
2.加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn):取一定量的樣品,加入已知量的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品,按照與標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的分析方法進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算加標(biāo)回收率。
加標(biāo)回收率應(yīng)在 90 - 110 之間,以驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性和可靠性。
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